【摘要】：研究背景: 嗜酸粒细胞性支气管炎(eosinophilic bronchitis, EB)是以咳嗽为唯一或主要表现,肺通气功能和气道反应性正常,诱导痰中嗜酸粒细胞(eosinophils,EOS)明显增多,皮质激素治疗有效的一类疾病。这一概念自1989年提出以来,引起众多学者的广泛关注。有人认为EB是一种独立的疾病,有人认为它是哮喘的早期表现,但EB的发病原因、病理机制还不十分清楚。目前EB的研究主要集中于临床患者,暂时还没有一个确切的EB动物模型。鉴于直接进行人体实验的局限性,有关病因的确定、发病机制的探索、治疗方法的评价、疾病的转归和新药的研发在很大程度上需要通过动物实验进行。因此建立EB动物模型对EB的深入研究具有重要意义。由于有大量相关分子生物学试剂及抗体供选择,尤其是基因敲除和转基因技术的广泛应用,小鼠在国内外已成为主要的实验动物。本课题拟采用小鼠作为实验对象,为进一步研究EB的发病机制提供来源广泛、成本低廉、背景简单、易于重复、可持续深入研究的EB动物模型。 慢性咳嗽是EB患者主要或唯一的临床症状,EB动物模型也应具有这一主要特征。由于小鼠生理解剖结构微小,声音信号极为微弱,小鼠有无咳嗽目前在国际上还存在很大争议。目前最多使用小鼠咳嗽模型进行研究的日本Junzo Kamei教授,主要通过观察小鼠腹部急速抽搐运动同时合并异常呼吸波形来进行小鼠咳嗽的判断。由于没有咳嗽声音的检测,因此说服力较弱,至今未得到国际公认。小鼠咳嗽检测成为制约小鼠EB模型建立的关键问题。建立基于小鼠咳嗽声音检测基础上的小鼠咳嗽检测方法,不仅是小鼠EB模型的基础条件,亦将为小鼠咳嗽模型得到国际公认提供更有说服力的依据,为咳嗽机理研究和镇咳药物的筛选提供更多的选择方式。 基因是遗传信息的载体,蛋白质是生命功能的直接执行者,对蛋白质的研究是跨越基因组与临床应用鸿沟的桥梁。近年来蛋白质组学技术在临床疾病的发病机制、诊断及治疗研究中得到了广泛应用。如果能够利用比较蛋白组学方法从临床和动物模型两个方面研究EB与正常群体和哮喘之间的差异所在,有可能找到EB疾病相关的生物标志,为其诊断和治疗干预提供新的视点。

研究目的: 1、建立小鼠咳嗽检测方法; 2、建立小鼠EB模型; 3、筛选EB的疾病相关蛋白。

研究内容: 第一部分小鼠咳嗽检测方法的建立 方法: 使用Buxco无创肺功能检测系统的密闭体描舱和本课题与美国Buxco公司合作开发的Finepointe(FP)小鼠咳嗽检测软件,在小鼠处于自由活动状态时,使用100μmol/L辣椒素雾化激发,在记录异常呼吸波形的同时,使用微型麦克风监听小鼠声音的性质,使用cooledit声音软件进行滤噪分析,逐步改进小鼠咳嗽的检测方法。使用辣椒平和辣椒素耗竭方法进行干预,观察小鼠咳嗽次数的变化,观察人工计数和软件自动计数的相关性和一致性。 结果: 建立了利用Buxco无创肺功能体描舱,使用FP小鼠咳嗽检测软件进行小鼠咳嗽检测的标准:即在观察到小鼠咳嗽波形的同时能够通过微型麦克风监听到清晰咳嗽声音,此时确定为一次小鼠咳嗽。经多种镇咳药物干预后,小鼠咳嗽次数显著减少。人工计数和软件自动计数的相关性为0.964,一致性为0.956.

结论: 1.小鼠咳嗽检测方法成功建立:该标准通过直接监听小鼠咳嗽声音并观察异常呼吸波形变化来确定是否小鼠咳嗽,无需观察小鼠腹部运动情况和分析声波变化。方法可信、简单易行,有利于小鼠咳嗽模型的推广和应用,同时为小鼠EB模型的建立奠定了基础。

2.小鼠咳嗽检测软件开发取得阶段性成果:使用Buxco无创肺功能体描舱,经过不断的改进和完善,开发的小鼠FP咳嗽检测软件具备较高的可信度,可为小鼠咳嗽模型的广泛应用起到推动作用。 第二部分嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型的建立 分题1 OVA滴鼻诱发小鼠无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症的剂量探索 方法: SPF级BALB/c雌性小鼠,分为生理盐水(normal saline, NS)组、哮喘(asthma, AS)组、低、中、高剂量鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA)滴鼻模型组(model, M-1、M-2、M-3组)共5组,每组8只。致敏方法:第0、7、14天OVA (10μg)腹腔注射。第21、22、23天,3个模型组和AS组每天使用0.02%、0.04%、0.2%和0.4%OVA50μl滴鼻激发;NS组在相同时间内使用NS进行致敏和激发。末次激发24小时(hour, h)后应用美国Buxco公司的有创气道阻力与肺顺应性检测系统(RC system)测定动物气道反应性、进行支气管肺泡灌洗观察气道炎症、HE染色观察气道周围炎症细胞尤其是嗜酸粒细胞的浸润程度。

结果: 1.气道反应性检测:末次激发24h后,各组基础肺阻力无显著差异。在吸入浓度为6.25、12.5、25、50mg/ml的乙酰甲胆碱(methacholine, MCh)时,AS组和NS组比较肺阻力(lung resistance, RL)显著增高。在各个MCh浓度激发点,M-1组小鼠和NS组比较无显著差异,而在6.25、12.5、25和50 mg/ml MCh激发点时,AS组小鼠肺阻力显著高于M-1组小鼠。M-2组小鼠和M-3组小鼠的肺阻力介于NS组和AS组小鼠之间。
2.肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)细胞分类计数:3个模型组和AS组BALF中巨噬细胞百分率显著低于NS组,而中性粒细胞、EOS和淋巴细胞百分率显著高于NS组,其中以EOS比例增高明显。 3.肺组织病理学检测:末次激发24h后,AS组小鼠支气管周围可见明显炎性细胞浸润,以EOS浸润为主。各模型组亦出现轻-中度的气管周围炎(炎性细胞浸润,以EOS和淋巴细胞浸润为主)及水肿。NS组气道纤毛上皮排列整齐,气管/血管周围无炎性细胞的浸润、无充血水肿。 结论: 使用10μg OVA腹腔致敏,10μg OVA滴鼻激发可成功建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型。 分题2小鼠咳嗽检测对气道反应性检测的影响

方法: 48只SPF级雌性BALB/c小鼠,分成两大部分,第一部分24只小鼠分为NS组、模型-1(M-1)组和AS组,按照分题1实验流程,常规造模行有创肺功能检测气道反应性,以了解模型是否建立成功。OVA末次滴鼻激发后24h时,NS组小鼠首先使用辣椒素刺激进行咳嗽检测,随后立即进行气道反应性检测,以了解辣椒素刺激对NS组小鼠气道反应性检测的影响。其余24只实验小鼠3组,分别为模型-2(M-2)组、模型-3(M-3)组和模型-4(M-4)组。各组小鼠分别在OVA末次滴鼻激发后6h,12h,24h进行咳嗽检测,OVA末次滴鼻激发后24h时进行气道反应性检测,以了解辣椒素刺激对模型组小鼠气道反应性检测的影响。 结果: 1.咳嗽检测:NS组小鼠咳嗽次数为(16±5)次/6min;M-2、M-3、M-4组在各个不同时间点检测到小鼠咳嗽次数分别为(24±6)、(22±6)和(25±6)次/6min,各模型组组间比较无显著差异,与NS组比较咳嗽次数显著增高。

2.气道反应性检测:末次滴鼻激发24h后NS组小鼠经辣椒素刺激行咳嗽检测,之后立即行有创肺功能检测气道反应性。NS组和M-1组小鼠在MCh为6.25-50 mg/ml激发浓度时与AS组比较均有显著差异;NS组和M-1组小鼠在MCh各个激发浓度下气道反应性无显著差异。M-2、M-3、M-4组小鼠气道反应性均与NS组及未进行辣椒素刺激的M-1组小鼠无显著差异;在MCh为6.25-50 mg/ml激发浓度时与AS组比较均有显著差异;M-2、M-3、M-4组小鼠组间比较气道反应性无差异。

结论: 模型建立后在各个时间点使用辣椒素刺激进行小鼠咳嗽检测对其后的小鼠气道反应性检测无影响。我们选择在OVA末次滴鼻后6h进行咳嗽检测,便于小鼠的正常作息及建立小鼠EB模型实验的时间安排。 分题3地塞米松对模型小鼠咳嗽和气道反应性的作用 32只SPF级雌性BALB/c小鼠,分为NS组、模型组、AS组和地塞米松组,每组8只。地塞米松组小鼠在模型组基础上,每次OVA滴鼻激发前1h及行气道反应性检测前1h予地塞米松进行干预。各组小鼠在OVA末次滴鼻激发后6h行咳嗽检测,末次滴鼻激发后24h进行有创气道反应性检测,进行支气管肺泡灌洗观察气道炎症,HE染色观察气道周围炎症细胞尤其是EOS的浸润程度。

结果: 1.咳嗽检测:OVA末次滴鼻激发后6h模型组和AS组小鼠咳嗽次数显著高于NS组;经地塞米松预处理后小鼠咳嗽次数较模型组显著降低;与NS组比较无显著差异。 2.气道反应性检测:OVA末次滴鼻激发后24h,AS组小鼠在MCh为6.25- 50mg/ml激发浓度时与NS组和模型组比较均有显著差异;在MCh各个激发浓度下,NS组和模型组比较均无显著差异;地塞米松组小鼠气道反应性在MCh浓度为12.5 mg/ml时较NS组轻度增高,其它各MCh浓度激发下与模型组和NS组比较均无显著差异。

3. BALF细胞分类计数:NS组小鼠肺泡灌洗液中EOS含量很少,不到1%,以Mac为主;经OVA激发后,模型组、AS组EOS和Neu显著增高,Mac含量显著下降;地塞米松干预后,EOS和Neu水平较模型组和AS组显著降低,但不能恢复到正常水平。 4.肺组织病理学检测:NS组气道纤毛上皮排列整齐,气管/血管周围无炎性细胞的浸润、无充血水肿;模型组出现轻-中度的气管周围炎及水肿;AS组小鼠支气管周围可见明显炎性细胞浸润,以EOS和淋巴细胞浸润为主;地塞米松组小鼠有轻度的气管周围炎。

结论: 地塞米松可有效降低模型组小鼠咳嗽次数,减轻EOS性气道炎症,不影响其气道反应性。 第二部分小结: 模型组小鼠与NS对照组比较,咳嗽次数显著增多,气道反应性无显著差异,气道嗜酸粒细胞显著增高,经地塞米松干预后相关指标显著减低,治疗有效,符合EB疾病的主要特征。提示OVA 10μg腹腔致敏,10μg滴鼻激发可成功建立小鼠EB模型。

第三部分:嗜酸粒细胞性支气管炎发生机制的蛋白组学研究 分题1 EB与哮喘患者肺泡灌洗液细胞差异蛋白组学研究 方法: 收集2007年5月——2008年12月因慢性咳嗽而于广州呼吸疾病研究所专科门诊的就诊患者,筛选符合标准的EB患者7人和AS患者(包括典型AS和CVA)9人,征集健康志愿者5人作为健康对照组。入选者均告知情况,签署知情同意书。纤维支气管镜下取BALF,分离细胞成分,采用二维凝胶电泳,进行硝酸银染色,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱方法进行差异蛋白组学研究。

结果: 经质谱鉴定发现AS、EB患者和健康志愿者BALF细胞中的8个差异蛋白。其中,AS患者蛋白浓度高于EB和健康对照组的为含区域LIM和SH3蛋白1(LASP1)、类肌动蛋白2(Actin-like protein 2)和含区域PDZ和LIM蛋白1(PDLIM1),属于肌动蛋白及其连接蛋白;EB和健康对照组高于AS患者的蛋白点有5个蛋白,其中健康人高于EB患者的2个蛋白HSPB1、CLPP,主要参与信号转导、应激抵抗和免疫应答等过程。 结论: 与哮喘组比较,EB患者BALF中LASP1、Actin-like protein 2和PDLIM1的低表达可能与EB不产生气道高反应性有关;与健康对照组比较,HSPB1和CLPP的低表达可能与EB气道炎症相关。

分题2 EB与哮喘小鼠肺组织差异蛋白组学研究
方法: 使用我们建立的小鼠EB模型与小鼠哮喘模型进行蛋白组学研究。12只SPF级雌性BALB/c小鼠,分为NS组、EB组和AS组,每组4只。小鼠末次激发24h后处死取出肺组织,利用固相pH梯度,采用二维凝胶电泳,进行考马斯亮兰染色,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱方法进行差异蛋白组学检测。 结果: 经质谱鉴定共发现22个差异蛋白,其中EB组低于AS组的有11个蛋白,主要涉及信号转导、细胞骨架运动、氧化应激和血浆渗透等方面,其中TAGL2与细胞平滑肌关系密切。EB组高于AS组的有11个蛋白,参与炎症反应、信号调节、氧化应激、细胞内吞等机体反应;其中EB组又高于NS组的4个蛋白可能与EB气道炎症关系密切。

结论: 同分题1的结果相似,细胞骨架成份仍然显示出与气道反应性的紧密联系。与平滑肌细胞关系密切的TAGL2蛋白具有较好的特异性,可能与EB不具备气道高反应性有关。

全文总结: 1.成功建立小鼠咳嗽检测方法:针对使用Buxco无创检测系统进行小鼠咳嗽检测确定了检测标准:即FP软件显示有咳嗽波形同时伴随有清晰咳嗽声音。 2.成功建立小鼠EB模型:具有咳嗽次数增加、无气道高反应性、有气道嗜酸粒细胞性炎症、激素干预有效的EB基本特征。 3.蛋白组学研究:通过临床和动物实验对AS、EB和健康对照组进行蛋白组学研究,显示细胞骨架成份与气道反应关系密切。与平滑肌细胞关系密切的TAGL2可能是指示EB不具备气道高反应性的较好的生物标志。